一、HPLC的應(yīng)用進(jìn)展

近幾年，HPLC儀器發(fā)展很快，HPLC的需求量猛增。我國(guó)年需求量約10000臺(tái)以上。全球每年需求約55億美元以上。很多原來(lái)用紫外光譜儀器分析檢測(cè)的工作，都因?yàn)镠PLC具有高分離效果的特點(diǎn)，而改為HPLC分析檢測(cè)。目前 HPLC在食品、藥品、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、環(huán)保等各行各業(yè)的科研、生產(chǎn)、質(zhì)量控制等領(lǐng)域有廣闊應(yīng)用前景，HPLC應(yīng)用的發(fā)展空間很大。

科技的發(fā)展HPLC應(yīng)用領(lǐng)域迅速擴(kuò)大，其中，常規(guī)藥物分析檢測(cè)方面的應(yīng)用覆蓋面猛增。1975年版的《美國(guó)藥典》（第19版）首次收載HPLC作為法定分析方法，當(dāng)時(shí)只有6個(gè)品種，到了第20版收載了80個(gè)，第21版增至418個(gè)，第22版增至1441個(gè)，目前收載的品種已經(jīng)超過(guò)2000個(gè)。（具體品種請(qǐng)讀者參考美國(guó)藥典）。

HPLC在中國(guó)各版藥典中的應(yīng)用（品種）逐年增加，也說(shuō)明HPLC在我國(guó)制藥行業(yè)的應(yīng)用發(fā)展很快。我國(guó)五年一版的藥典中，規(guī)定用HPLC檢測(cè)的藥品品種持續(xù)增長(zhǎng)，2010年版中藥品品種的增長(zhǎng)幅度很大，增長(zhǎng)的絕對(duì)數(shù)量已達(dá)到2000多種。其中，采用HPLC方法檢測(cè)的藥品和有關(guān)物質(zhì)的增加項(xiàng)目，由2005年版的142種增加到707種；含量測(cè)定的藥品采用HPLC法檢測(cè)的品種，由2005年版的359種增加到694種。（具體品種請(qǐng)讀者參考中國(guó)藥典）。

HPLC在藥品打假領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展非常迅速。目前，假藥、劣藥是困擾全球藥物發(fā)展的重要問(wèn)題之一，已受到各國(guó)政府的高度重視。據(jù)北京大學(xué)藥學(xué)院韓南銀教授報(bào)道，全球藥品銷售中，大約有6%左右的藥品為假冒偽劣產(chǎn)品。對(duì)假藥、劣藥的治理與打擊， HPLC是蕞有效的檢測(cè)儀器之一。

HPLC對(duì)違禁添加壯yang類藥物的檢測(cè)也很有用。例如，枸櫞酸西地那非（sildenafil citrate）（俗稱wei哥Viagra）是由美國(guó)輝瑞（Pfizer）制藥公司研制生產(chǎn)的一種治療心絞痛的藥物，在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其對(duì)治療某痿有特殊的效果，后來(lái)廠家將其以治療的藥物申報(bào)。美國(guó)FDA于1998年3月27日正式批準(zhǔn)該藥作為治療某痿的專用藥物。許多補(bǔ)shen壯yang的中藥以及中藥保健品摻入了西地那非。中國(guó)食品藥品檢定研究院的張啟民教授專門測(cè)定了22個(gè)廠家、10多種劑型的65批產(chǎn)品，發(fā)現(xiàn)其中13批非法摻入了枸櫞酸西地那非。另外，也有不少補(bǔ)shen壯yang中藥以及中藥保健品摻入了他達(dá)拉非，因?yàn)樗寞熜?yōu)于西地那非。但是，他達(dá)拉非的毒副作用大，容易引起頭痛、消化不良、顏色分辨能力下降等，有可能導(dǎo)致心腦血管疾病患者突然死亡，故服用后果嚴(yán)重。

還有，手性藥物領(lǐng)域的應(yīng)用。中國(guó)科學(xué)院“十一五”信息化建設(shè)專項(xiàng)的“手性藥物、農(nóng)藥及其中間體拆分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)”中，搜集了600多種商用手性藥物，涵蓋了528種全合成手性藥物的大部分和一部分半合成手性藥物，其中已拆分的藥物400多種。數(shù)據(jù)庫(kù)提供了詳細(xì)的拆分方法和拆分條件，并配以結(jié)構(gòu)式、分子式、分子量、結(jié)構(gòu)譜圖及藥物主要作用，以及盡可能多的其他藥物信息，可為藥物手性分析研究及手性藥品檢測(cè)提供頗具價(jià)值的參考依據(jù)。特別重要的是，它為我們進(jìn)一步建立手性藥物、農(nóng)藥及其中間體拆分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)打下了基礎(chǔ)。

目前，許多有機(jī)藥物的分子結(jié)構(gòu)中有不對(duì)稱碳原子，又稱手性碳原子，這樣的藥物具有旋光性。立體構(gòu)型不同的對(duì)映體，其藥效、毒副作用也往往不相同。經(jīng)常是一種對(duì)映體，具有強(qiáng)的生物活性和藥效，而另一種卻無(wú)藥效，甚至有毒性的現(xiàn)象。但對(duì)映體在普通條件下的理化性質(zhì)相同，故分離對(duì)映體比較困難，需要在手性拆分條件下進(jìn)行。如大多數(shù)氨基酸都有右旋體和左旋體，但往往只能獲得兩者的混合物（消旋體）。又如，氯霉素（有2個(gè)手性碳），只有D-(-)異構(gòu)體有藥效，而L-(+)異構(gòu)體則完全無(wú)藥效。再比如反應(yīng)停（thalidomide，沙利度胺）事件：20世紀(jì)60年代前后，歐美至少15個(gè)國(guó)家的醫(yī)生都在使用這種藥治療婦女妊娠反應(yīng)，很多人吃了藥后的確就不吐了，惡心的癥狀得到了明顯的改善，于是它成了“孕婦的理想選擇”（當(dāng)時(shí)的廣告用語(yǔ)）。于是，“反應(yīng)?！北淮罅可a(chǎn)、銷售，僅在聯(lián)邦德國(guó)就有近100萬(wàn)人服用過(guò)“反應(yīng)停”，“反應(yīng)停”每月的銷量達(dá)到了1噸的水平。在聯(lián)邦德國(guó)的某些州，患者甚至不需要醫(yī)生處方就能購(gòu)買到“反應(yīng)停”。但隨即而來(lái)的是，許多出生的嬰兒都是短肢畸形，形同海豹，被稱為“海豹肢畸形”。1961年，這種癥狀終于被證實(shí)是孕婦服用“反應(yīng)?！彼鶎?dǎo)致的。于是，該藥被禁用。然而，受其影響的嬰兒已多達(dá)1.2萬(wàn)名。后來(lái)，人們才發(fā)現(xiàn)，有關(guān)藥物機(jī)構(gòu)并未仔細(xì)檢驗(yàn)“反應(yīng)?！笨赡軙?huì)因?yàn)槭中援悩?gòu)體未拆分，而產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，蕞終迫使“反應(yīng)停”的銷售者支付了賠償。所以，1992年，美國(guó)FDA規(guī)定新藥臨床前研究必須要做手性異構(gòu)體的拆分研究。因?yàn)?，?duì)映體中的左旋體（S）有致畸胎作用、右旋體CAN有鎮(zhèn)靜安眠作用。因此，采用HPLC對(duì)手性異構(gòu)體的分離，在藥物的制備和質(zhì)量控制方面，具有重要的意義。

在討論HPLC的應(yīng)用的進(jìn)展中，以下幾個(gè)方面值得廣大科技工作者特別重視：

1、聯(lián)用技術(shù)蓬勃發(fā)展

目前，在科研生產(chǎn)工作中，科技工作者經(jīng)常將兩者儀器聯(lián)用，這樣能解決這兩種儀器單獨(dú)無(wú)法解決的問(wèn)題。一旦兩種儀器聯(lián)用，往往會(huì)出現(xiàn)一大片意想不到的、廣闊的新天地。因此，聯(lián)用技術(shù)受到了廣大科技工作者的重視。目前HPLC的聯(lián)用技術(shù)發(fā)展很快，因?yàn)镠PLC具有很好的分離效力，能夠?qū)芏鄰?fù)雜體系樣品（例如中藥、食品等等）進(jìn)行分離。所以，HPLC可以很方便的與光譜、色譜、質(zhì)譜等很多儀器聯(lián)用，組成新的分析系統(tǒng)。例如：HPLC-AAS（高效液相色譜-原子吸收光譜）、 HPLC-UVS（高效液相色譜-紫外可見(jiàn)光譜）、HPLC-AFP（高效液相色譜-原子熒光光度計(jì)）、HPLC-MS（高效液相色譜-質(zhì)譜）、HPLC-IR（高效液相色譜-紅外光譜）、HPLC-NMR（高效液相色譜-核磁共振）、HPLC-Sers Raman（高效液相色譜-表面增強(qiáng)的拉曼光譜）等等。

這些HPLC聯(lián)用系統(tǒng)，可以解決聯(lián)用系統(tǒng)中各單種儀器不能單獨(dú)解決的分析難題，非常受廣大分析工作者的青睞。例如：根據(jù)被測(cè)元素的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)不同，采用HPLC與AAS或AFP聯(lián)用，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)食品藥品中重金屬無(wú)機(jī)化合物、有機(jī)化合物的分離、分析檢測(cè)，具有分離效果好、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。例如：

1）用HPLC與AFP聯(lián)用，對(duì)不同價(jià)位（形態(tài)）的As能作分析檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果的譜圖如下：

(1)對(duì)5種砷的檢測(cè)

按照出峰時(shí)間先后為：1.砷膽堿，2.砷甜菜堿，3.二甲基砷，4.一甲基砷，5.砷酸根（濃度：砷甜菜堿500μg/L；砷酸根、一甲基砷、二甲基砷、砷膽堿100μg/L）

(2)對(duì)大米中 As的分析檢測(cè)譜圖

按出峰時(shí)間先后為：1.三價(jià)砷，2.二甲基砷。

2）HPLC與一機(jī)兩用的紫外/熒光光譜儀器聯(lián)用，取得了很好的效果：

作者應(yīng)中科院上海有機(jī)所的著名有機(jī)化學(xué)家汪猷教授的要求，并且在他的指導(dǎo)下，研發(fā)成功了UV/FL（紫外/熒光）一機(jī)兩用的光譜儀器（后轉(zhuǎn)給南京分析儀器廠投產(chǎn)，至今未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外有成熟的商品儀器，該儀器獲得了國(guó)家發(fā)明獎(jiǎng)）。

后來(lái)作者和汪猷教授將該儀器作為HPLC的檢測(cè)器（組成聯(lián)用系統(tǒng)），結(jié)果，對(duì)核酸的研究工作起到了非常好的效果。此前，國(guó)內(nèi)外的科技工作者在核酸研究工作中，對(duì)核苷的分析檢測(cè)使用HPLC時(shí)，采用紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器兩種檢測(cè)器串聯(lián)使用來(lái)檢測(cè)發(fā)熒光、不發(fā)熒光、有紫外吸收和沒(méi)有紫外吸收的核苷。結(jié)果峰形擴(kuò)展、譜線增寬、分析時(shí)間增加，使用成本增加。將HPLC與UV/FL紫外熒光光譜儀器聯(lián)用后，只需要8微升樣品，就可以方便的將發(fā)熒光、不發(fā)熒光、有紫外吸收、沒(méi)有紫外吸收的核苷分開(kāi)并檢測(cè)出來(lái)，可以方便地鑒別對(duì)某一波長(zhǎng)既有紫外吸收又有熒光發(fā)射的物質(zhì)A、只有紫外吸收而無(wú)熒光發(fā)射的物質(zhì)B、以及只有熒光發(fā)射（采用衍生法）而無(wú)紫外吸收的物質(zhì)C。對(duì)A、B和C三種物質(zhì)的檢測(cè)，非常簡(jiǎn)便。

HPLC與UV/FL聯(lián)用后，可以很方便的對(duì)苯、萘、聯(lián)苯三種混合物的定性分析；儀器條件為色譜柱ODS（C18），4.6×200mm；流動(dòng)相為甲醇：水=80：20；流速：1.0ml/min；

柱壓力： l00kg/cm2；樣品：苯、萘、聯(lián)苯混合物，濃度為每ml甲醇中含苯1.0μL、萘0.5mg、聯(lián)苯0.9mg；進(jìn)樣量：3μL；參比池充滿移動(dòng)相。UV×1（0.01AUFS）；FL×1（蕞靈敏檔）；波長(zhǎng)254nm；PMT負(fù)高壓525V；氘燈電流250mA；記錄儀：UV×20mV；FL×10mV，記錄儀紙速：4mm/min。

HPLC與UV/FL聯(lián)用后，可以解決多肽化合物（L-亮氨酸、T絲氨酸、D+T亮氨酸與絲氨酸混合物）的分離檢測(cè)。分析時(shí)的儀器條件：色譜柱：ODS(C18)，4.6×300mm；流動(dòng)相為乙睛：醋酸銨=20:80；流速：1.05mL/min；量程：UV：0.1AUFS，F(xiàn)L×1；波長(zhǎng)210nm；負(fù)高壓750V；氘燈恒流電流300ma；記錄儀：UV×100mv；FL×5mv；紙速：4mm/min；樣品：L-亮氨酸、D-亮氨酸和絲氨酸混合物；三種氨基酸都溶解在移動(dòng)相中, L-亮氨酸濃度為C=1.lx10-4g/ml；D-亮氨酸濃度C=4.5×10–5g/ml；T-絲氨酸濃度C=3.6×10-5g/ml；三者的混合為1:1:1；進(jìn)樣量：10μL；參比池充滿移動(dòng)相。

HPLC的聯(lián)用技術(shù)發(fā)展迅猛，應(yīng)用例子很多很多，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不是一兩篇文章能講清楚的，并且HPLC與有關(guān)儀器聯(lián)用的問(wèn)題，目前是廣大使用HPLC的科技工作者最關(guān)心的問(wèn)題之一，建議廣大科技工作者引起高度重視。

2、HPLC在元素形態(tài)分析領(lǐng)域的應(yīng)用目前大顯身手

關(guān)于元素的形態(tài)分析，目前國(guó)際上尚無(wú)權(quán)威的定義，不同學(xué)者有不同的定義，包括：狀態(tài)（state）、形式（form）、物種（species）。國(guó)際理論化學(xué)與應(yīng)用協(xié)會(huì)（IUPAC）定義元素形態(tài)分析（analysis of elemental speciation）為：“確定分析物質(zhì)的原子和分子組成形式的過(guò)程”。 在學(xué)術(shù)界，一般都認(rèn)為：“確定某種組分在所研究系統(tǒng)中的具體存在形式及分布，就叫做形態(tài)分析”。

很多元素，特別是很多微量元素，它們有的對(duì)人類非常有用，是人類不可缺少的元素。但是，很多微量元素都有不同的形態(tài)（或價(jià)位）。例如：三價(jià)Cr是一種能治療糖尿病的藥，而6價(jià)Cr則是ju毒的物質(zhì)；Hg也是有很多不同形態(tài)的元素，例如甲基汞、乙基汞等等。不同形態(tài)的汞，毒性大不相同；還有As，五價(jià)As是有機(jī)As，屬于低毒物質(zhì)，而三價(jià)As是p霜，是劇毒物質(zhì)。物質(zhì)中的這些不同形態(tài)（或價(jià)位）的微量元素，往往需要做形態(tài)分析，才能準(zhǔn)確檢測(cè)出其不同形態(tài)的組分的含量。這些形態(tài)分析的儀器，很多都是HPLC與有關(guān)的光譜儀器聯(lián)用。例如：As-90就是HPLC-AAS聯(lián)用組成的形態(tài)分析儀器。它就能解決三價(jià)As（無(wú)機(jī)As，P霜）的檢測(cè)，并且參與解決了我國(guó)歷史上光緒皇帝之死的謎團(tuán)。

光緒三十四年（一九0八年十月二十一日）酉時(shí)，光緒皇帝突然死亡，只比慈禧太后早死20個(gè)小時(shí)。根據(jù)當(dāng)時(shí)的各種跡象分析，大家認(rèn)為光緒是被害而死，但是因?yàn)闆](méi)有證據(jù)。后來(lái)，1938年易縣的崇陵被盜，光緒皇帝的遺物等暴露在外，直到1980年清理易縣崇陵墓和光緒皇帝的遺物等、并重新封閉崇陵時(shí)，當(dāng)時(shí)的歷史學(xué)家、檔案學(xué)家、醫(yī)學(xué)家等科技工作者們經(jīng)過(guò)認(rèn)真檢查，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)光緒有什么外傷痕跡，亦無(wú)中毒表現(xiàn)。所以，得出結(jié)論：既無(wú)中毒或傷害現(xiàn)象，也無(wú)突然性早死的跡象，應(yīng)該屬正常死亡。直到21世紀(jì)初，由于法國(guó)重新核查拿破侖的真正死因，光緒的死因謎案再次提出。此時(shí)，我國(guó)組織了有關(guān)的物理學(xué)家、儀器學(xué)家、化學(xué)家等，采用中子活化技術(shù)、X衍射技術(shù)、形態(tài)分析（HPLC-AAS）技術(shù)、原子熒光檢測(cè)技術(shù)等等反復(fù)檢測(cè)驗(yàn)證，結(jié)果表明：光緒皇帝的頭發(fā)中三價(jià)As的zui高含量達(dá)到2404μg/g（正常人0.24～1.0），為隆?；屎蟮?61倍，草料官的132倍，且為一般慢性中毒者的66倍，墓外土壤樣品的97倍，僅龍袍及相關(guān)部位檢出砷總量已高達(dá)到201 .5mg（人的口服致死量為>60mg）。各種檢測(cè)中胃部衣物上三價(jià)As含量zui大，其他部位應(yīng)是由腐敗尸體溢流侵蝕所致。所以，結(jié)論是：光緒皇帝系p霜中毒死亡。

HPLC在形態(tài)分析中的應(yīng)用例子舉不勝舉，請(qǐng)讀者參閱作者2014年出版的《高效液相色譜儀器及其應(yīng)用》一書。

3、在應(yīng)用領(lǐng)域中應(yīng)該重視以下幾個(gè)方面

1)環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用

生活用水及工業(yè)用水和廢水中酚類化合物的分析檢測(cè)、苯胺類化合物的分析檢測(cè)、廢水中阿特拉津（除草劑）的分析檢測(cè)、空氣中的苯胺類化合物的分析檢測(cè)等等，一般都是采用HPLC。這些檢測(cè)方法，在中國(guó)的《空氣和廢氣監(jiān)測(cè)分析方法》、《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》等標(biāo)準(zhǔn)中都已經(jīng)明文規(guī)定，此不贅述。

2)食品藥品領(lǐng)域的應(yīng)用

蕞近幾年，出現(xiàn)了很多由用UVS 檢測(cè)向用HPLC檢測(cè)轉(zhuǎn)換的工作，很值得大家重視。藥品領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)在前面作了簡(jiǎn)單介紹，此不贅述。HPLC在食品分析檢測(cè)中的應(yīng)用，值得重視的主要有：

(1)食品含量：各類酸、有機(jī)胺、礦物質(zhì);食品添加劑;甜味劑、防腐劑、著色劑（合成色素如檸檬黃、莧菜紅等）、抗氧化劑、增白劑等等。

(2)食品污染物：霉菌毒素：黃曲霉毒素、黃桿菌毒素、大腸桿菌毒素等。

(3)保健食品GMP認(rèn)證、食品GMP認(rèn)證等等也少不了HPLC儀器。可以說(shuō)，HPLC是食品工業(yè)、食品衛(wèi)生檢測(cè)與監(jiān)督等實(shí)驗(yàn)室不可缺少的分析儀器之一。

3)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用

農(nóng)藥殘留檢測(cè)：多種有機(jī)磷農(nóng)藥，如敵百蟲、乙基對(duì)氧磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥等;

食品和飼料中硝基呋喃的藥物檢測(cè)：呋喃唑酮（痢特靈）、呋喃西林、呋喃妥因等殘留量分析檢測(cè);飼料中的苯乙胺類（PEAS）藥物分析檢測(cè)、鹽酸克倫特羅檢測(cè)等規(guī)定用HPLC，其中農(nóng)業(yè)部頒發(fā)強(qiáng)制性行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定》一定要用HPLC。

4)生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

低分子量物質(zhì)：如氨基酸、有機(jī)酸、有機(jī)胺、卟啉、糖類、維生素等的分離和測(cè)定；高分子量物質(zhì)：如多肽、核糖核酸、蛋白質(zhì)和酶（各種胰島素、激素、細(xì)胞色素、干擾素等）的純化、分離和測(cè)定。

5)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

體液中代謝物測(cè)定;藥代謝動(dòng)力學(xué)研究;臨床藥物監(jiān)測(cè)常規(guī)化驗(yàn)等等。

由于HPLC具有高速度、高分離效果、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，所以其應(yīng)用發(fā)展非常神速;目前，幾乎所有需要分離的大分子有機(jī)物分析工作，它都可以發(fā)揮優(yōu)勢(shì)?？梢灶A(yù)言，HPLC儀器的應(yīng)用，將在“農(nóng)、輕、重、海、陸、空，吃、穿、用”等各個(gè)領(lǐng)域、各行各業(yè)無(wú)所不在、無(wú)所不有。

二、用好HPLC的一些關(guān)鍵問(wèn)題：

從儀器學(xué)理論、分析誤差理論、分析化學(xué)和作者的長(zhǎng)期實(shí)踐來(lái)全面討論：

1、泵、柱、檢測(cè)器三者的關(guān)系的認(rèn)識(shí)和目前使用者普遍存在的問(wèn)題

目前很多研發(fā)、使用HPLC的科技工作者，沒(méi)有搞清楚或沒(méi)有完全搞清楚HPLC中的泵、柱、檢測(cè)器三者的關(guān)系。國(guó)內(nèi)外很多生產(chǎn)廠商只是生產(chǎn)泵、檢測(cè)器，色譜柱子都是外購(gòu)件。我們說(shuō)HPLC是一個(gè)系統(tǒng)，是指泵、柱、檢測(cè)器三者組成的一個(gè)完整的系統(tǒng)。如果只生產(chǎn)泵、檢測(cè)器，就不能說(shuō)是生產(chǎn)完整的HPLC儀器，只是生產(chǎn)了HPLC的兩種部件，再買一根色譜柱組裝成一臺(tái)儀器后出售。所以，這樣生產(chǎn)的HPLC系統(tǒng)，到了用戶那里，總是不好用或者不大好用。而廣大使用者，由于沒(méi)有將HPLC的泵、柱、檢測(cè)器三者互相影響的關(guān)系搞清楚，所以不能將HPLC用到zui佳水平（得到誤差最小的zui佳分析檢測(cè)數(shù)據(jù)）。以本人長(zhǎng)期的研發(fā)和使用HPLC的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為研發(fā)、使用HPLC時(shí)，以下問(wèn)題特別值得注重：

正確認(rèn)識(shí)、處理HPLC的泵、柱、檢測(cè)器三者的關(guān)系：

(1) HPLC是一個(gè)系統(tǒng)，必須將泵、柱、檢測(cè)器三者（三個(gè)部件）結(jié)合起來(lái)才能叫HPLC。三者都合格，聯(lián)機(jī)后的整機(jī)系統(tǒng)才有可能合格，但不能肯定系統(tǒng)就會(huì)合格。只有泵、柱、檢測(cè)器三者質(zhì)量都合格，并且聯(lián)機(jī)后檢測(cè)結(jié)果也合格，才能說(shuō)明這臺(tái)HPLC是合格的。

(2) 三個(gè)部件都重要，不能偏重哪一方面。三者誰(shuí)是核心？誰(shuí)蕞重要？目前，光譜、色譜工作者對(duì)此看法都各不相同、各有表述，我們不必去追究這些。作者認(rèn)為應(yīng)該說(shuō)三者是一個(gè)整體，缺一不可，都很重要。

(3)本人長(zhǎng)期使用過(guò)HPLC，也研發(fā)過(guò)HPLC儀器，實(shí)踐使本人深深認(rèn)識(shí)到：必須將三個(gè)部件聯(lián)接起來(lái)檢驗(yàn)測(cè)試，并能達(dá)到質(zhì)量指標(biāo)要求，才能說(shuō)這臺(tái)HPLC達(dá)到了質(zhì)量要求。否則，只能說(shuō)是部件合格，而整機(jī)系統(tǒng)不一 定能合格。為什么? 因?yàn)椋?/span>

①泵會(huì)因?yàn)橹訂?wèn)題產(chǎn)生壓力不穩(wěn)、流量不穩(wěn)定，會(huì)影響HPLC系統(tǒng)的質(zhì)量；

②柱對(duì)泵影響很大：柱堵塞、柱沾污、柱接頭漏液等，都會(huì)影響泵的壓力波動(dòng)、使流速不穩(wěn)定，會(huì)影響系統(tǒng)不穩(wěn)，使RSD變壞、峰拖尾、靈敏度降低;

③柱對(duì)檢測(cè)器影響很大：柱效降低（柱塔板數(shù)降低）、柱堵塞、柱的新舊程度、接頭、管道漏液等，都會(huì)影響檢測(cè)器的檢測(cè)限、分辨率、噪聲、和靈敏度。

請(qǐng)注意：色譜柱是易損件，用戶會(huì)經(jīng)常在色譜柱長(zhǎng)時(shí)間使用后換新柱，此時(shí)HPLC系統(tǒng)的泵和檢測(cè)器基本進(jìn)入“電子元件失效理論”的盆底，比較穩(wěn)定了。所以，不會(huì)因?yàn)閾Q新柱而產(chǎn)生儀器不能使用的問(wèn)題。特別應(yīng)該指出的是：用戶換新柱后，一般不檢測(cè)系統(tǒng)的綜合指標(biāo)。如果檢測(cè)指標(biāo)，可能就不能達(dá)到原出廠指標(biāo)（因?yàn)楸煤蜋z測(cè)器經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)期使用后，質(zhì)量會(huì)有所下降，舊泵、新柱、舊檢測(cè)器三者不能達(dá)到zui佳配備），但是不會(huì)影響使用。

用戶換新柱不會(huì)影響使用的問(wèn)題，可以從計(jì)量認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范（JJG）得到佐證。JJG檢驗(yàn)的儀器，很多是在用儀器，它明確規(guī)定被檢儀器的指標(biāo)可以比新出廠的儀器指標(biāo)低，甚至有些指標(biāo)因?yàn)檫_(dá)不到要求而免檢。但我們的制造企業(yè)，在儀器出廠前，必須檢測(cè)系統(tǒng)的指標(biāo)，只有系統(tǒng)指標(biāo)達(dá)到設(shè)計(jì)要求時(shí)，才算合格，才能出廠。至于用戶換新檢測(cè)器、換新泵、同樣都是允許的。

2、使用者應(yīng)該對(duì)色譜柱及柱外的有關(guān)問(wèn)題引起高度重視

1)色譜峰拖尾：與柱、流動(dòng)相的流速、試樣等有關(guān)，發(fā)現(xiàn)拖尾一定要從這些方面查找原因；

2)如何延長(zhǎng)色譜柱壽命：保養(yǎng)很重要，長(zhǎng)期不用時(shí)用甲醇浸泡著，嚴(yán)格控制洗柱時(shí)間或洗柱溶劑體積，一般經(jīng)常使用的柱，下班時(shí)應(yīng)該用甲醇（或水：甲醇為20：80）洗 45分鐘或20倍床體積；

3)必須注意對(duì)“柱外效應(yīng)”的控制。所謂“柱外效應(yīng)”，就是指HPLC系統(tǒng)中，除柱系統(tǒng)外，管路、連接件、進(jìn)樣器和流動(dòng)池的死體積等引起的色譜峰增寬效應(yīng)。

4) 進(jìn)樣：自動(dòng)進(jìn)樣時(shí)，應(yīng)該經(jīng)常檢測(cè)自動(dòng)進(jìn)樣器，對(duì)儀器進(jìn)樣器要求穩(wěn)定可靠；手動(dòng)進(jìn)樣時(shí)，應(yīng)該特別注意取樣時(shí)的細(xì)節(jié)，進(jìn)樣時(shí)的手感（輕、重、緩、急）等。

3、HPLC的使用者應(yīng)該特別注重對(duì)色譜柱質(zhì)量的判斷

1)色譜柱的柱效：塔板數(shù)高者好，特別要注意影響柱效的因素，塔板數(shù)降到一定程度該柱就報(bào)廢了。

2)重復(fù)性：一根柱子反復(fù)使用時(shí)，蕞好RSD能夠保持小于0.1%。

3)耐用性（壽命）：因?yàn)橹Ш苋菀捉档?，所以需要重視?duì)柱的保護(hù)。

4)色譜柱使用后一定要進(jìn)行清洗，以免造成腐蝕、阻塞、降低塔板數(shù)。一般應(yīng)該用20倍床體積沖洗，隔幾天再用的HPLC，蕞好用20%甲醇：80%水沖洗30分鐘左右后，再用純甲醇沖洗20分鐘 后保存。

4、HPLC的使用者應(yīng)該特別重視流動(dòng)相問(wèn)題

1)PH值特別重要：一般C18柱PH小于3時(shí)，容易損壞色譜柱，但是抗酸性的柱可以使用小的PH值。

2) 注意選擇試劑的截止波長(zhǎng)：如乙腈截止波長(zhǎng)215nm、丙酮截止波長(zhǎng)330nm、正丁烷210nm等等（具體情況請(qǐng)讀者參閱本文的參考文獻(xiàn)）。

3)流速：流速要適當(dāng)，否則影響峰形、浪費(fèi)溶劑，一般常規(guī)分析工作大多選擇1ml/min。

5、使用者應(yīng)該注重溶劑前處理

蕞好使用HPLC級(jí)的優(yōu)質(zhì)溶劑，使用前必須過(guò)濾和脫氣。注意以下幾點(diǎn)：

1)過(guò)濾目的：溶劑進(jìn)泵前和樣品注射前應(yīng)該過(guò)濾除去溶劑中的微小顆粒、微生物，保證泵和色譜柱不會(huì)堵塞或損壞，保證分析數(shù)據(jù)可靠。

2)對(duì)過(guò)濾器的要求和zui佳孔徑選擇方法：對(duì)過(guò)濾器總的要求：速度快、溶出度小、死體積小、精確的孔徑、體積適當(dāng)、化學(xué)兼容性好等。

蕞佳孔徑選擇方法：如果色譜柱填料直徑小于3μm或除菌過(guò)濾，一般選擇0.2μm孔徑；如果色譜柱填料直徑大于5μm，則選0.45μm；如果是預(yù)過(guò)濾或過(guò)濾難過(guò)濾的樣品，一般選1μm孔徑。特別是對(duì)使用無(wú)機(jī)鹽配制的緩沖液，更要注意選擇合適的過(guò)濾器！否則，不可能得到可靠的分析測(cè)試數(shù)據(jù)!

3)脫氣：主要目的是：除去流動(dòng)相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡。液相色譜流動(dòng)相脫氣使用較多的是離線超聲波振蕩脫氣、在線惰性氣體鼓泡吹掃脫氣和在線真空脫氣。流動(dòng)相的氣泡進(jìn)入液相泵會(huì)引起壓力的上下波動(dòng)，危害很大，必須除之，可以打開(kāi)排空閥，大流速?zèng)_洗。

6、使用者應(yīng)該注重緩沖液?jiǎn)栴}

1) 緩沖液使用前必須過(guò)濾。

2) 溶劑、樣品易受到細(xì)菌和霉菌的影響，要注意清潔。

3)一般不能直接用有機(jī)溶劑做清洗沖洗。

4)梯度洗脫時(shí)，選低吸收值的緩沖液 。例如：梯度洗脫時(shí)，緩沖液與有機(jī)相應(yīng)預(yù)混，以防止析鹽。在保證峰不拖尾的情況下，盡可能選用低濃度的緩沖鹽，防止析鹽； 緩沖鹽濃度，一般用20～30mM基本上就可以了，如果流動(dòng)相中有機(jī)相含量高的話，流動(dòng)相中的鹽類緩沖液濃度就不能過(guò)高，鹽的濃度起碼要保證在流動(dòng)相條件下不會(huì)析出。離子對(duì)緩沖液濃度要高一點(diǎn)，一般50～100mM。

7、研發(fā)者、使用者還特別需要重視12個(gè)常見(jiàn)的技術(shù)問(wèn)題。

這12個(gè)問(wèn)題是作者的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，是用好HPLC的科技工作者必須重視的問(wèn)題。（請(qǐng)讀者參考《李昌厚，高效液相色譜儀器及其應(yīng)用，北京：科學(xué)出版社，2014》一書）。

8、使用者必須重視進(jìn)樣器的清洗問(wèn)題

進(jìn)樣器或進(jìn)樣針請(qǐng)注意三點(diǎn)：

A、對(duì)進(jìn)樣器要求：自動(dòng)進(jìn)樣和取樣速度快、有些儀器進(jìn)樣時(shí)間僅17秒。

B、進(jìn)樣室要求可控:一般用帕爾帖冷卻，溫控范圍4℃～100℃。

C、特別要應(yīng)注意進(jìn)樣殘留量的清洗（主要是清洗針）：洗針后，進(jìn)樣殘留物由前面的0.07% 降到0.05%，結(jié)果非常好。

9、使用者應(yīng)該重視HPLC的線性動(dòng)態(tài)范圍（Linear Dynanic Range-LDR）及其測(cè)試方法

1)線性動(dòng)態(tài)范圍的定義

國(guó)際上科技工作者對(duì)HPLC的線性動(dòng)態(tài)范圍的定義是：蕞大線性區(qū)（保證1%相對(duì)誤差的線性區(qū)域）的吸光度值A(chǔ)max，除以蕞小線性區(qū)（保證1%相對(duì)誤差的線性區(qū)域）的吸光度值A(chǔ)min。即LDR=Amax/Amin；或蕞大線性區(qū)的濃度Cmax除以蕞小線性區(qū)的濃度Cmin，即LDR=Cmax/Cmin。

2)HPLC的線性動(dòng)態(tài)范圍的重要性（對(duì)分析測(cè)試誤差的影響）

定量分析檢測(cè)時(shí)，如果HPLC使用在非線性動(dòng)態(tài)區(qū)，肯定會(huì)因非線性而產(chǎn)生誤差。為了保證分析測(cè)試結(jié)果的可靠性，我們應(yīng)使用在HPLC的線性動(dòng)態(tài)區(qū)。因此，線性動(dòng)態(tài)范圍是一切HPLC使用者必須高度重視的技術(shù)指標(biāo)。

一般來(lái)說(shuō)，使用者拿到一臺(tái)HPLC儀器后，總是希望對(duì)很稀的樣品分析時(shí)，其分析測(cè)試的結(jié)果在所要求的誤差范圍內(nèi)。對(duì)很濃的樣品分析時(shí)，其分析測(cè)試的結(jié)果也在所要求的誤差范圍內(nèi)。這就只有HPLC的線性動(dòng)態(tài)范圍很寬的時(shí)候才能做到。有人認(rèn)為，樣品太稀時(shí)，濃縮一下就好了，樣品太濃時(shí)，稀釋一下就是了。這是不了解分析工作或未親自作過(guò)分析工作的人說(shuō)的話。因?yàn)椋瑵饪s一下或稀釋一下談何容易？首先是增加工作量，稀釋或濃縮工作很麻煩;第二，稀釋或濃縮會(huì)帶來(lái)誤差。所以我們總是希望HPLC的線性動(dòng)態(tài)范圍大（寬）且好。

HPLC的線性動(dòng)態(tài)范圍，一般取決于儀器檢測(cè)器的噪聲和雜散光。國(guó)內(nèi)外很多HPLC的生產(chǎn)廠商不給出HPLC的線性動(dòng)態(tài)范圍。作者認(rèn)為不給線性動(dòng)態(tài)范圍是不對(duì)的，因?yàn)椴唤o線性動(dòng)態(tài)范圍，就意味著不知道這臺(tái)HPLC分析的樣品濃度的上限和下限。綜上所述，HPLC的線性動(dòng)態(tài)范圍非常重要，它將限制儀器的使用范圍（即限制儀器的適用性）。很遺憾的是許多科技工作者目前還未對(duì)線性動(dòng)態(tài)范圍引起重視。

3)線性動(dòng)態(tài)范圍測(cè)試方法

HPLC的線性動(dòng)態(tài)范圍的測(cè)試方法有多種。我國(guó)的計(jì)量檢定規(guī)程JJG705-2002規(guī)定：波長(zhǎng)254nm時(shí)，采用“丙酮/2%異丙醇水溶液（丙酮含量為0.1%、0.2%、….1.0%）沖洗檢測(cè)池，并記下各溶液對(duì)應(yīng)的穩(wěn)定記錄儀讀數(shù)；由CH/CL算出檢測(cè)器的線性范圍（CH濃度上限、CL濃度下限）。”作者認(rèn)為這種方法很不妥。因?yàn)闈舛鹊南孪奘怯?jì)算出來(lái)的，不是真正測(cè)試出來(lái)的下限。采用的計(jì)算公式為：CL=2NCV/H×20（公式本身有錯(cuò)誤）；并且算出的下限值達(dá)到千萬(wàn)分之三點(diǎn)一（即：0.000031%）。這樣的數(shù)據(jù)有什么意義？作者認(rèn)為這種測(cè)試線性范圍的測(cè)試方法既不符合儀器學(xué)理論，又不與國(guó)際接軌，有關(guān)部門應(yīng)該盡快更正。

目前，國(guó)際上對(duì)線性動(dòng)態(tài)范圍的測(cè)試方法，一般是配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品（以數(shù)量級(jí)遞增），直接在儀器上測(cè)試其吸光度。求出偏離比耳定律1%時(shí)的蕞大吸光度Amax和蕞小吸光度Amin。二者相除即是儀器的線性動(dòng)態(tài)范圍LDR（Linine Dinamic Rangi）。即LDR=Amax/Amin。其具體操作是：HPLC儀器設(shè)置縱坐標(biāo)為吸光度A，橫坐標(biāo)為濃度C；檢測(cè)器的光譜帶寬為2nm；波長(zhǎng)設(shè)置可以在紫外區(qū)（如要求很高時(shí)可設(shè)置在253.7nm），也可在可見(jiàn)區(qū)（如500nm）；試樣可任選，濃度從小到大，依次對(duì)所配試樣進(jìn)行測(cè)試。作曲線，從曲線上找出偏離線性在1%以內(nèi)的范圍。此范圍內(nèi)的Amax/Amin就是線性動(dòng)態(tài)范圍。

作者在研發(fā)HPLC的UV/FLD時(shí)，就是根據(jù)儀器學(xué)理論，從線性動(dòng)態(tài)范圍的物理概念出發(fā)，自己配置蒽不同濃度的溶液，以數(shù)量級(jí)遞增，測(cè)出能保證1%相對(duì)誤差的下限點(diǎn)和上限點(diǎn)，二者相除，得出其線性動(dòng)態(tài)范圍，效果非常好。

三、希望和建議

1、希望廣大HPLC使用者打破崇洋媚外的思想，大膽使用能滿足使用要求的國(guó)產(chǎn)儀器。

我國(guó)對(duì)各類HPLC年需求量達(dá)10000臺(tái)以上。中國(guó)有20多家制造商生產(chǎn)HPLC，但是只占市場(chǎng)的20%左右，而國(guó)外占領(lǐng)中國(guó)市場(chǎng)80%左右。UHPLC儀器2013年我國(guó)進(jìn)口1000臺(tái)，每臺(tái)10萬(wàn)美元，只是這一個(gè)產(chǎn)品，我國(guó)一年總共花掉1億美元進(jìn)口。實(shí)際上，我國(guó)上海伍豐公司、福建福立公司等都能生產(chǎn)UHPLC，質(zhì)量都能滿足使用要求，性價(jià)比大大優(yōu)于進(jìn)口產(chǎn)品，并且出口美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家。但是國(guó)人就是要花大價(jià)錢去買進(jìn)口UHPLC，實(shí)在是令人費(fèi)解。

國(guó)產(chǎn)HPLC多次招標(biāo)中戰(zhàn)勝國(guó)外品牌的例子很多，例如：對(duì)三聚氰胺建立國(guó)標(biāo)時(shí)，在國(guó)標(biāo)中采用哪種HPLC儀器，招標(biāo)過(guò)程中，在難以取舍的情況下，采用比對(duì)測(cè)試方法，結(jié)果國(guó)產(chǎn)HPLC儀器一舉戰(zhàn)勝國(guó)外公司的產(chǎn)品。專家們根據(jù)比對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、儀器的性價(jià)比等評(píng)價(jià)儀器的標(biāo)準(zhǔn)，一致通過(guò)采用北京普析通用公司的L6（目前升級(jí)為L(zhǎng)600），國(guó)產(chǎn)HPLC打敗了兩家進(jìn)口HPLC儀器，成為我國(guó)三聚氰胺國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中推薦的唯一國(guó)產(chǎn)HPLC儀器。

作者認(rèn)為，我們中國(guó)的科技工作者要從民族高度看國(guó)產(chǎn)儀器和進(jìn)口儀器。要大膽使用能滿足使用要求的國(guó)產(chǎn)儀器（但是有極少數(shù)儀器離真正能滿足使用要求還有差距，使用者在購(gòu)買HPLC時(shí)應(yīng)該高度重視之）。我們千萬(wàn)不能盲目迷信外國(guó)產(chǎn)品。當(dāng)然盲目排外也是不對(duì)的，目前我國(guó)還不能生產(chǎn)的儀器，特別是有些高端HPLC，我們還是應(yīng)該進(jìn)口，并且一定要消化、吸收，為我所用。

2、建議廣大科技工作者努力學(xué)習(xí)、不斷提高自己的專業(yè)技術(shù)水平。

認(rèn)真吸取前人的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，認(rèn)真參考有關(guān)文獻(xiàn)，不斷提高HPLC儀器制造和使用水平，為趕超國(guó)際先進(jìn)水平努力奮斗。建議大家認(rèn)真參考下述文獻(xiàn)：

(1)李昌厚著，高效液相色譜儀器及其應(yīng)用，北京：科學(xué)出版社，2014

(2)李昌厚著，儀器學(xué)理論與實(shí)踐，北京：科學(xué)出版社，2008

(3)李昌厚著，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)儀器及其應(yīng)用，北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010

(4)高效液相色譜（HPLC）儀器及其最新進(jìn)展和有關(guān)問(wèn)題（儀器信息網(wǎng)專題論壇）

致謝：本文寫作過(guò)程中，參閱了北京大學(xué)藥學(xué)院韓南銀教授、浙江大學(xué)郭偉強(qiáng)教授的有關(guān)學(xué)術(shù)報(bào)告，作者在此一并致謝?？浦鷥x器根據(jù)網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)載亦有刪減，如有不妥請(qǐng)聯(lián)系本公，諒解。